madrid2i

Resumen

The present invention relates to a method for the characterization of the mechanisms of cellular secretion in response to depolarizing stimuli consisting of determining the membrane capacity (cm) in voltage fixing mode, rapidly changing the cells as a current fixation and apply said stimulus and determine the cm of the cell in a voltage setting mode again where the difference between the final and initial value of cm is a measure of the exocytotic response of the cell. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Reivindicaciones

1. 1. Un método para medir la respuesta exocitóticade una célula a un estímulo despolarizante que comprende las etapasde 2. a. determinar en modo de fijación devoltaje un valor C1 correspondiente a la Cm de la célula enestado basal 3. b. cambiar rápidamente a modo de fijaciónde corriente y aplicar dicho estímulo y 4. c. cambiar rápidamente a modo de fijaciónde voltaje y determinar un valor C2 correspondiente a la Cm dela célula 5. en donde el valor de la diferencia entre losvalores C2 y C1 es una medida de la respuesta exocitótica de lacélula. 6. 2. Un método según la reivindicación 1 en el quela transición entre las etapas a y b y/o entre las etapas b y c seefectúa en el orden de milisegundos. 7. 3. Un método para medir el efecto de ladespolarización de membrana en una célula sobre la respuestaexocitótica de dicha célula a un estímulo despolarizante quecomprende las etapas de 8. a. determinar en modo de fijación devoltaje un valor C1 correspondiente a la Cm de la célula enestado basal (C1) , 9. b. poneren contacto dicha célula con dicho estímulo y determinar en modo defijación de voltaje un valor C2 correspondiente a la Cm de lacélula tras la estimulación 10. c. eliminar el estímulo y mantener lacélula en condiciones de voltaje constante hasta que se estabilicela Cm y determinar un valor C3 correspondiente a la Cm dela célula tras la estabilización, 11. d. cambiar rápidamente a modo de fijaciónde corriente y aplicar de nuevo dicho estímulo y 12. e. cambiar rápidamente a modo de fijaciónde voltaje y determinar un valor C4 correspondiente a la Cm dela célula. 13. en donde un valor positivo de la diferencia (C4-C3) - (C2-C1) indica que almenos parte de la respuesta exocitótica de la célula al estímulorequiere de la despolarización de la membrana. 14. 4. Un método según las reivindicación 2 en elque la transición entre las etapas c y d y/o entre las etapas d ye se efectúa en el orden de milisegundos. 15. 5. Un método según cualquiera de lasreivindicaciones 1 a 4 en el que el estímulo despolarizante seselecciona del grupo de un ligando capaz de provocar la apertura deun canal iónico, un ligando capaz de provocar un trasiego iónico através de la membrana de la célula y una inyección de corriente quegenere un potencial de acción en el modo de fijación decorriente. 16. 6. Un método según cualquiera de lasreivindicaciones anteriores en el que la aplicación del ligando serealiza de manera ultracorta, preferiblemente del orden demilisegundos, y/o repetitiva, preferiblemente con una frecuencia de0.1 a 100 Hertzios. 17. 7. Un método según cualquiera de lasreivindicaciones anteriores en el que la célula se selecciona delgrupo de una célula cromafín y una célula pancreática β. 18. 8. Un método según cualquiera de lasreivindicaciones anteriores en el que la célula es una célulacromafín y el estímulo despolarizante es acetilcolina o al menos unagonista nicotínico. 19. 9. Un método según las reivindicaciones 2 a 8 enel que la etapa inicial de determinación de la Cm en respuestaal estímulo se lleva a cabo en presencia de al menos un antagonistadel receptor. 20. 10. Un método según la reivindicación 9 en elque la célula secretora es una célula cromafín, el ligando es unagonista de un receptor acoplado a un canal iónico y el antagonistaes un antagonista nicotínico. 21. 11. Un método según cualquiera de lasreivindicaciones 1 a 9 en el que la medida se lleva a cabo enpresencia de un potenciador/activador de los receptores. 22. 12. Un método según cualquiera de lasreivindicaciones 1 a 11 en el que la célula posee al menos un canalde calcio dependiente de voltaje. 23. 13. Un método según las reivindicación 12 en elque el canal de calcio dependiente de voltaje se selecciona delgrupo de un canal tipo L, un canal tipo N, un canal tipo P/Q, uncanal tipo T y un canal tipo R. 24. 14. Un método según la reivindicación 12 ó 13 enel que la célula se ha tratado previamente con al menos un compuestoque causa la eliminación de las reservas intracelulares decalcio. 25. 15. Un método según cualquiera de lasreivindicaciones 12 a 14 en el que la medida se lleva a cabo enpresencia de un potenciador/activador de los canales de calcio. 26. 16. Un método para la identificación deinhibidores o activadores de la secreción en respuesta a un estímulodespolarizante que comprende las etapas de 27. a. determinar en modo de fijación devoltaje un valor C1 correspondiente a la Cm basal 28. b. cambiar rápidamente a modo de modo defijación de corriente y aplicar dicho estímulo en presencia delcompuesto cuya actividad inhibidora o activadora se desea ensayary 29. c. cambiar rápidamente a modo de modo defijación de voltaje y determinar un valor C2 correspondiente a laCm de la célula 30. en donde un valor de la diferencia entre C2 y C1menor que el valor de dicha diferencia obtenido en ausencia dedicho compuesto indica que el compuesto es inhibidor de la secreciónen respuesta al estímulo despolarizante y donde un valor de ladiferencia entre C2 y C1 mayor que el obtenido en ausencia de dichocompuesto indica que el compuesto es activador de la secreción enrespuesta al estímulo despolarizante. 31. 17. Un método según cualquiera de lasreivindicación 16 en el que la transición entre las etapas a y b y/oentre las etapas b y c se realiza en el orden de milisegundos. 32. 18. Un método para la identificación deinhibidores o activadores de la secreción en respuesta a ladespolarización de la membrana por un estímulo despolarizante quecomprende las etapas de 33. a. determinar en condiciones de voltajeconstante un valor C1 correspondiente a la Cm basal de lascélulas, 34. b. poneren contacto dicha células con dicho estímulo en modo de fijación devoltaje y determinar un valor C2 correspondiente a la Cm delas células tras la estimulación, 35. c. eliminar el estímulo y mantener lacélula en condiciones de voltaje constante hasta que se estabilicela Cm y determinar un valor C3 correspondiente a la Cm dela célula tras la estabilización, y 36. d. cambiar rápidamente a modo de modo defijación de corriente y aplicar de nuevo dicho estímulo en presenciadel compuesto cuya actividad inhibidora o activadora se deseaensayar y 37. e. determinar a continuación en modo defijación de voltaje un valor C4 correspondiente a la Cm de lacélula 38. en donde un valor de (C4-C3) - (C2-C1) menor que elobtenido en ausencia de dicho compuesto indica que el compuesto esinhibidor de la secreción en respuesta a la despolarización de lamembrana y donde valor de (C4-C3) - (C2-C1) mayor que elobtenido en ausencia de dicho compuesto indica que el compuesto esactivador de la secreción en respuesta a la despolarización de lamembrana. 39. 19. Un método para la identificación deinhibidores o activadores de un canal de calcio dependiente devoltaje en una célula que contiene dicho canal de calciodependiente de voltaje y al menos un receptor acoplado a un canalcatiónico que comprende 40. a. determinar en condiciones de voltajeconstante un valor C1 correspondiente a la Cm de lacélula, 41. b. poneren contacto dicha célula con un estímulo despolarizante en modo defijación de voltaje, 42. c. determinar un valor C2 correspondientea la Cm de las células tras la estimulación, 43. d. eliminar el estímulo y mantener lacélula en condiciones de voltaje constante hasta que se estabilicela Cm y determinar un valor C3 correspondiente a la Cm dela célula tras la estabilización, 44. e. cambiar rápidamente a condiciones decorriente constante y añadir de nuevo dicho estímulo despolarizanteen presencia del compuesto cuya actividad como activador oinhibidor de los canales de calcio se desea ensayar hasta que elpotencial de membrana sea el adecuado para la apertura del canal decalcio dependiente de voltaje y 45. f. cambiar rápidamente al modo de fijaciónde voltaje y determinar un valor C4 correspondiente a la Cm dela célula 46. en donde un valor de la diferencia (C4-C3) - (C2-C1) menor que el aumentoobservado en ausencia del compuesto indica que el compuesto inhibeel canal de calcio dependiente de voltaje y donde un valor de ladiferencia (C4-C3) - (C2-C1) mayorque el valor observado en ausencia del compuesto indica que elcompuesto activa el canal de calcio dependiente de voltaje. 47. 20. Un método según cualquiera de lasreivindicaciones 18 ó 19 en el que la transición entre las etapas dy e y/o entre las etapas e y f se realiza en el orden demilisegundos. 48. 21. Un método según las reivindicaciones 16 a 20en el que la célula es una célula cromafin. 49. 22. Un método según la reivindicación 21 en elque el estímulo despolarizante es un agonista de un receptor deneurotransmisores acoplado a un canal iónico, preferiblementeacetilcolina o un agonista colinérgico. 50. 23. Un programa de ordenador que incluye medioscodificados para llevar a cabo los pasos del método según cualquierade las reivindicaciones 1 a 22. 51. 24. Un medio legible por ordenador en el cual sealmacenan medios codificados adaptados para llevar a cabo los pasossegún cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23. 52. 25. Un sistema automatizado de microelectrodospara realizar estudios de patch-clamp que contieneel programa definido en la reivindicación 23 o el medio legibledefinido en la reivindicación 24. 53. 26. Un sistema según la reivindicación 25 que esun amplificador patch-clamp.

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