Thermostable polypeptide with penicillin acylase activity, variants thereof and their applications. A thermostable polypeptide with penicillin acylase activity and functionally equivalent variants thereof, a process for obtaining it and its use in the production of 6-aminopenicillanic acid (6-apa) is described. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)
1. REIVINDICACIONES 2. 1. Un polipéptido con actividad penicilina acilasa que comprende la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente del mismo, con la condición de que dicho polipéptido no es el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 2. 3. 2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende al menos una mutación puntual en relación con la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 1, que consiste en la sustitución de un aminoácido presente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 por otro aminoácido, en donde dicho aminoácido presente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo formado por la leucina en posición 151 (Leu 151), la serina en posición 152 (Ser 152), la leucina en posición 242 (Leu 242) y/o la isoleucina en posición 275 (Ile 275). 4. 3. Polipéptido según la reivindicación 2, en el que al menos uno de dichos aminoácidos Leu 151, Ser 152, Leu 242 y/o Ile 275 es sustituido por un aminoácido aromático. 5. 4. Polipéptido según la reivindicación 3, en el que dicho aminoácido aromático es fenilalanina. 6. 5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho polipéptido es estable a una temperatura comprendida entre 57,5ºC y 82,5ºC. 7. 6. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que presenta una temperatura óptima de actividad penicilina acilasa a aproximadamente 75 ºC. 8. 7. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho polipéptido es estable a un pH comprendido comprendido entre 3 y 9. 9. 8. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que presenta un pH óptimo de actividad penicilina acilasa en presencia de penicilina K a aproximadamente pH 4. 10. 9. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que presenta un pH óptimo de actividad penicilina acilasa en presencia de penicilina G a aproximadamente pH 8. 11. 10. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que hidroliza una penicilina con un grupo carboxamida hidrofóbico unido a la posición 6 del anillo penam a través del átomo de nitrógeno. 12. 11. Polipéptido según la reivindicación 10, en donde dicha penicilina con un grupo carboxamida hidrofóbico unido a la posición 6 del anillo penam a través del átomo de nitrógeno se selecciona del grupo formado por penicilina K, penicilina F, penicilina dihidro F, penicilina V y penicilina G. 13. 12. Una proteína de fusión que comprende: 14. i) un polipéptido A que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y 15. ii) un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B es un polipéptido diferente a dicho polipéptido A. 16. 13. Proteína de fusión según la reivindicación 12, en la que dicho polipéptido B es un péptido señal de secreción extracelular o un polipéptido útil para aislar y/o purificar proteínas. 17. 14. Proteína de fusión según la reivindicación 12 ó 13, en la que dicho polipéptido B se selecciona del grupo formado por una cola de histidinas, una cola de argininas, FLAG-tag, Strep-tag, x-myc-tag, SBP-tag, S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a 18. quitina, glutatión S-transferasa-tag, proteína de unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, βgalactosidasa y VSV-glicoproteína. 19. 15. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14. 20. 16. Una construcción génica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 15. 21. 17. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 15 o una construcción génica según la reivindicación 16. 22. 18. Vector según la reivindicación 17, en el que dicho vector es un vector de expresión. 23. 19. Un organismo que comprende un polinucleótido según la reivindicación 15, una construcción génica según la reivindicación 16, o un vector según la reivindicación 16 ó 17. 24. 20. Organismo según la reivindicación 19, en el que dicho organismo es un organismo mesófilo. 25. 21. Organismo según la reivindicación 20, en el que dicho organismo mesófilo es una bacteria mesófila. 26. 22. Un procedimiento para obtener un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que comprende cultivar un organismo que comprende un polinucleótido según la reivindicación 15 bajo condiciones que permiten la producción de dicho polipéptido o dicha proteína de fusión, y, si se desea, recuperar dicho polipéptido o proteína de fusión. 27. 23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicho organismo es un organismo mesófilo. 28. 24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicho organismo mesófilo es un organismo mesófilo procariota. 29. 25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que dicho organismo es Escherichia coli. 30. 26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 que comprende producir dicho polipéptido o dicha proteína de fusión junto con una proteína del sistema de chaperonas. 31. 27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que dicha proteína del sistema de chaperonas es una proteína seleccionada del grupo formado por DnaK/J, GrpE, factor desencadenante y GroEL/ES. 32. 28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que dicha proteína del sistema de chaperonas es DnaK/J y/o GrpE. 33. 29. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que las proteínas del sistema de chaperonas son GroEL/ES. 34. 30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29, en el que la producción del polipéptido o proteína de fusión comprende el cultivo de dicho organismo en presencia de Ca2+. 35. 31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que el Ca2+ está presente a una concentración comprendida entre mayor que 0 y 50 mM. 36. 32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que el Ca2+ está presente a una concentración de aproximadamente 10 mM. 37. 33. Un método para obtener ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) que comprende poner en contacto una penicilina con un grupo carboxamida hidrofóbico unido a la posición 6 del anillo penam a través del átomo de nitrógeno con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o con una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13 bajo condiciones que permitan la hidrólisis de dicha penicilina. 38. 34. Método según la reivindicación 33, en el que dicha penicilina con un grupo carboxamida hidrofóbico unido a la posición 6 del anillo penam a través del átomo de nitrógeno se selecciona del grupo formado por penicilina K, penicilina F, penicilina dihidro F, penicilina V y penicilina G. 39. 35. Un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11. 40. 36. Anticuerpo según la reivindicación 35, que reconoce específicamente la sub-unidad alfa de dicho polipéptido, en donde dicha sub-unidad alfa se sitúa entre el aminoácido en posición 1 y el aminoácido en posición 218 en la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 1. 41. 37. Anticuerpo según la reivindicación 35, que reconoce específicamente la sub-unidad beta de dicho polipéptido, en donde dicha sub-unidad beta se sitúa entre el aminoácido en posición 219 y el aminoácido en posición 739 en la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 1. 42. Fig. 1 43. Fig. 2 Fig. 3 44. Fig. 4 Fig. 5 45. Fig. 6 Fig. 7 46. Fig. 8 Fig. 9 47. Fig. 10 Fig. 11 48. Fig. 12 A 49. Fig. 13 Fig. 14 50. Fig. 15