Resumen
Polymorphism in the promoter of the human gene for apolipoprotein E, and its uses for diagnostic and therapeutic applications. Method for detecting the presence of DNA polymorphism, test kit and corresponding recombinant nucleic acids. The method consists of analysing human genome DNA, clones genome DNA and genome DNA amplified through the use of oligonucleotide molecules as sensors which hybridise with a portion of the apolipoprotein E gene. In another variant, detection is performed by digesting the DNA with one or more restriction enzymes or through the use of different electrophoretic techniques. The test kit is characterised by a specific quantity of one or more labelled oligonucleotide sensors, a specified quantity of one or more restriction enzymes and the means necessary for amplification of the DNA. The recombinant nucleic acid used in the method contains any fragment of the apolipoprotein E gene promoter which includes a specific series of nucleotides of the gene mentioned. The invention is applicable to the diagnosis and treatment of Alzheimer's disease, arteriosclerotic coronary disease and other clinical syndromes associated with apolipoprotein E.
Reivindicaciones
1. 1. Método para detectar in vitro la presencia de polimorfismos deDNA en la región del promotor del gen humano de laapolipoproteína E, consistente en analizar DNA genómico humano,DNA genómico clonado o DNA genómico amplificado, usandomoléculas de oligonucleótidos como sondas que hibridan con unaporción del gen de la apolipoproteína E que incluye nucleótidoscorrespondientes a los nucleótidos -491, -427, -219 y +113 del gende la apolipoproteína E, donde las sondas hibridan con la porciónen cuestión cuando la base del nucleótido -491 es adenina, para untipo de sonda específica para un alelo, o timina para el otro tipo; labase del nucleótido -427 es citosina, para un tipo de sondaespecífica para un alelo, o timina para el otro tipo; la base delnucleótido -219 es guanina, para un tipo de sonda específica paraun alelo, o timina para el otro tipo; y la base del nucleótido +113 escitosina, para un tipo de sonda específica para un alelo, o guaninapara el otro tipo. 2. 2. Método para detectar in vitro la presencia de polimorfismos deDNA en la región del promotor del gen humano de laapolipoproteína E consistente en analizar DNA genómico, DNAgenómico clonado o DNA genómico amplificado, mediante ladigestión del DNA con una o varias enzimas de restricción quereconocen sitios de ruptura distinguiendo un alelo del gen de laapolipoproteína E de los otros alelos, y después analizando losfragmentos de DNA para determinar el tipo de gen de apolipopoproteína E. 3. 3. Método para detectar in vitro la presencia de polimorfismos deDNA en la región del promotor del gen humano de la apolipoproteína E,consistente en analizar DNA genómico, DNA genómico clonado o DNA genómicoamplificado, mediante la utilización de diferentes técnicaselectroforéticas, tales como DGGE (electroforesis en geles de gradientedesnaturalizante), SSCP (polimorfismo conformacional de una hebra),secuenciación, y otras conocidas en el arte. 4. 4. Cualquier ácido nucleico capaz de hibridar específicamente con losácidos nucleicos representados en la Fig. 1, o con sus secuenciascomplementarias para el diagnóstico in vitro de cualquierpredisposición genética para la enfermedad de Alzheimer, enfermedadcoronaria arterosclerótica y otros síndromes clínicos asociados con laapolipoproteína E. 5. 5. Estuche de ensayo para llevar a cabo uno cualquiera de los métodos dediagnóstico in vitro de las reivindicaciones 1, 2, 3 y 4,caracterizado por: 6. una cantidad definida de una o más sondas de oligonucleótidosmarcadas que distinguen un alelo del gen de la apolipoproteína de losotros alelos, y/o 7. una cantidad definida de una o más enzimas de restricción quedistinguen un alelo de los otros, y/o 8. los medios necesarios para la amplificación de DNA que comprende unaporción del gen de la apolipoproteína E que incluye cualquiera de losnucleótidos -491, -427, -219, y +113 del mencionado gen. 9. 6. Método de diagnóstico in vitro de cualquier predisposicióngenética para la enfermedad de Alzheimer, enfermedad coronariaarterosclerótica y otros síndromes clínicos asociados con laapolipoproteína E basado en el ensayo de la actividad transcripcional delpromotor de APOE. caracterizado por: (A) obtenciónde DNA genómico de un individuo, (B) amplificación delDNA genómico conteniendo cualquier fragmento de la región delpromotor del gen APOE que incluya cualquiera de los nucleótidos-491, -427, -219, +113 del mencionado gen, para obtener DNAgenómico amplificado, (C) clonaje de cada uno de los dos alelos de laregión del promotor de APOE a partir del DNA genómicoamplificado, (D) ligamiento de las dos secuencias de DNA genómicoclonado correspondientes a cada uno de los dos alelos del individuoa un gen reportero, (E) introducción de los genes de fusión encélulas en cultivo o en animales, y (F) medida de la actividad delgen reportero. 10. 7. Método de diagnóstico in vitro de cualquier predisposicióngenética para la enfermedad de Alzheimer, enfermedad coronariaarterosclerótica y otros síndromes clínicos asociados con laapolipoproteína E basado en el ensayo de la actividad transcripcional delpromotor de APOE, caracterizado por: (A) obtenciónde DNA genómico de un individuo, (B) clonaje de cada unode los dos alelos del gen APOE, conteniendo cualquier fragmento dela región del promotor que incluya cualquiera de los nucleótidos-491, -427, -219, +113 del mencionado gen, a partir del DNAgenómico, (C) ligamiento de las dos secuencias de DNAgenómico clonado correspondientes a cada uno de los dos alelos delindividuo a un gen reportero, (D) introducción de los genes de fusión encélulas en cultivo o en animales, y (E) medida de la actividad del genreportero. 11. 8. El uso de cualquier ácido nucleico recombinante conteniendo cualquierfragmento del promotor del gen APOE que incluyacualquiera de los nucleótidos -491, -427, -219, +113 del mencionadogen, ligado a un gen reportero para el ensayo de la actividadtranscripcional del promotor de APOE como un método para elensayo in vitro de potenciales compuestos para el tratamiento de laenfermedad de Alzheimer, enfermedad coronaria arterosclerótica yotros síndromes clínicos asociados con la apolipoproteína E. 12. 9. Estuche de ensayo para llevar a cabo uno cualquiera de los métodos dediagnóstico in vitro de las reivindicaciones 6, 7 y 8. 13. 10. El uso de los métodos para detectar la presencia depolimorfismos de DNA en la región del promotor del gen humano de laapolipoproteína E de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 y 5; y de losmétodos de ensayo de la actividad transcripcional del promotor deAPOE de las reivindicaciones 6, 7, 8 y 9, para la selección potencialde pacientes para el estudio de respuesta a fármacos y para larealización de ensayos clínicos de terapias efectivas para laenfermedad de Alzheimer, enfermedad coronaria arterosclerótica yotros síndromes clínicos asociados con la apolipoproteína E.
