The present invention relates to a reverse two-hybrid method for the identification of missense-type mutations that prevent the binding of two interacting proteins. The invention also describes gene constructs that can be used in the method of the invention, as well as the host cell which comprises said constructs and can be used in the method of the invention.
REIVINDICACIONES Método in vitro para identificar al menos una mutación missense en una proteína de referencia donde dicha mutación afecta a la capacidad de unión de dicha proteína de referencia con otra proteína diana, donde dicho método comprende: a) al menos una célula huésped que comprende integrado en su genoma: i) Una primera secuencia nucleotídica que codifica para un gen reportero, donde dicha secuencia nucleotídica está operativamente unida a un promotor que comprende una secuencia nucleotídica reconocida por una proteína que se une al ADN, ii) Una segunda secuencia nucleotídica que codifica para un segundo gen reportero, donde dicha segunda secuencia nucleotídica está operativamente unida a un promotor que comprende una secuencia nucleotídica reconocida por una proteína que se une al ADN, con la condición de que dicha secuencia nucleotídica sea reconocida por un dominio de unión al ADN distinto del de i), y iii) Una tercera secuencia nucleotídica que codifica para una primera proteína de fusión que comprende el dominio de unión al ADN de ii) y una proteína heteróloga, capaz de unirse a un péptido funcional localizado en el extremo C-terminal de la proteína de referencia de estudio, donde la secuencia nucleotídica que codifica para dicha primera proteína de fusión está operativamente unida a un promotor, b) Pre-transformar la célula de la etapa a) con un plásmido que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para una segunda proteína de fusión que comprende el dominio de unión al ADN de i) y la proteína diana, donde la secuencia nucleotídica que codifica para dicha segunda proteína de fusión está operativamente unida a un promotor, c) Cultivar la célula de la etapa b) bajo condiciones que permitan exclusivamente el crecimiento de las células que hayan incorporado el plásmido de la etapa b), d) Transformar la célula de la etapa c) con un vector linearizado y al menos un fragmento de ADN que previamente ha sido sometido a mutagénesis y que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína de referencia con al menos una mutación, donde entre el vector linearizado y el fragmento de ADN sometido a mutagénesis se produce recombinación homologa obteniéndose un plásmido que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para una tercera proteína de fusión que comprende el dominio de transactivación de Gal4 y la proteína de referencia con al menos una mutación, donde la secuencia nucleotídica que codifica para dicha tercera proteína de fusión está operativamente unida a un promotor, e) Cultivar la célula de la etapa d) bajo condiciones tales que permitan exclusivamente el crecimiento de las células que presentan mutaciones missense que impiden la unión entre la proteína de referencia y la proteína diana, f) Comparar la secuencia de la proteína de referencia mutada con la secuencia de la proteína de referencia wild-type e identificar la mutación missense que impide la unión de la proteína de referencia con la proteína diana. Método según la reivindicación 1 donde el procedimiento de mutagénesis al que ha sido sometido el fragmento de ADN de la etapa d) es un procedimiento de mutagénesis in vitro o in vivo. Método según la reivindicación 1 donde el plásmido de la etapa d) se obtiene mediante recombinación in vivo "gap-repait" . Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el gen reportero se selecciona de entre genes reporteros de selección positiva y genes reporteros de contra-selección. Método según la reivindicación 4 donde los genes reporteros de selección positiva se seleccionan del grupo que consiste en: HIS3, LEU2, URA3, ADE2, TRP1, LYS2 y LYS5; y los genes reporteros de contra-selección se seleccionan del grupo que consiste en: URA3, TRP1, LYS2, LYS5, CYH2, CAN1, GAL1 y mazF. 6. Método según la reivindicación 5 donde el gen reportero de selección positiva es el gen HIS3, y el gen reportero de contra-selección es el gen URA3 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde las secuencias de reconocimiento para dominios de unión al ADN comprenden los sitios de unión de una proteína seleccionada de entre cualquiera de las siguientes: Gal4, LexA y Ace1. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde la secuencia nucleotídica que codifica para un dominio de transactivación comprende los dominios de activación transcripcional de una proteína seleccionada de entre cualquiera de las siguientes: Gal4, VP16 y Acel 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde los promotores son promotores constitutivos. 10. Método según la reivindicación 9 donde los promotores constitutivos se seleccionan de entre cualquiera de la lista que consiste en: ADH1, PGK1, TEF1, TPI1, HXT7, TDH3 y PYK1. 1 1. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde la proteína heteróloga es la proteína de SEQ ID NO: 32, y el péptido funcional es el péptido de SEQ ID NO: 12. 12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde la primera proteína de fusión es la proteína de SEQ ID NO: 49. 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde la segunda proteína de fusión es la proteína de SEQ ID NO: 51. 14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: célula de levadura, célula bacteriana y célula de mamífero. 15. Método según la reivindicación 14 donde la célula de levadura se selecciona del grupo que consiste en Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris y Scacharomyces cerevisiae, preferentemente la célula de levadura pertenece a la especie S. cerevisiae. 16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 donde la célula es OVY216. 17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 caracterizado por que las células que presentan al menos una mutación missense, crecen en un medio de cultivo que comprende 5-FoA y 3-AT, y carece de triptófano, leucina, adenina e histidina. 18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 donde la identificación de las mutaciones missense, se lleva a cabo mediante técnicas de amplificación y secuenciación. 19. Célula huésped que comprende integrado en su genoma: i) Una primera secuencia nucleotídica que codifica para un gen reportero, donde dicha secuencia nucleotídica está operativamente unida a un promotor que comprende una secuencia de reconocimiento para una proteína que se une al ADN, ii) Una segunda secuencia nucleotídica que codifica para un segundo gen reportero, donde dicha segunda secuencia nucleotídica está operativamente unida a un promotor que comprende una secuencia de reconocimiento para una proteína que se une al ADN, con la condición de que dicha secuencia de reconocimiento sea diferente de la secuencia de reconocimiento de i), y iii) Una tercera secuencia nucleotídica que codifica para una primera proteína de fusión que comprende el dominio de unión al ADN de ii) y una proteína heteróloga capaz de unirse a un péptido funcional localizado en el extremo C-terminal de la proteína de referencia, donde la secuencia nucleotídica que codifica para dicha primera proteína de fusión está operativamente unida a un promotor. 20. Célula huésped según la reivindicación 17, donde el gen reportero se selecciona de la lista que consiste en genes reporteros de selección positiva y genes reporteros de contra-selección. 21. Célula huésped según la reivindicación 20 donde los genes reporteros de selección positiva se seleccionan del grupo que consiste en: HIS3, LEU2, URA3, ADE2, TRP1, LYS2, LYS5; y los genes reporteros de contra-selección se seleccionan del grupo que consiste en: URA3, TRP1, LYS2, LYS5, CYH2, CAN1, GAL1, mazF. 22. Célula huésped según la reivindicación 21 donde el gen reportero de selección positiva es el gen HIS3, y el gen reportero de contra-selección es el gen URA3 23. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 donde las secuencias de reconocimiento para dominios de unión al ADN comprenden los sitios de unión de una proteína seleccionada de entre cualquiera de las siguientes: Gal4, LexA y Acel 24. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 donde la secuencia nucleotídica que codifica para un dominio de transactivación comprende los dominios de activación transcripcional de una proteína seleccionada de entre cualquiera de las siguientes: Gal4, VP16 y Ace1. 25. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24 donde los promotores son promotores constitutivos. 26. Célula huésped según la reivindicación 25 donde los promotores constitutivos se seleccionan de entre cualquiera de la lista que consiste en: ADH1, PGK1, TEF1, TPI1, HXT7, TDH3 y PYK1. 27. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26 donde la proteína heteróloga es la proteína de SEQ ID NO: 32, y el péptido funcional es el péptido de SEQ ID NO: 12. 28. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27 donde la primera proteína de fusión es la proteína de SEQ ID NO: 49. 29. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28 dónde la célula se selecciona del grupo que consiste en: célula de levadura, célula bacteriana y célula de mamífero. 30. Célula huésped según la reivindicación 29 donde la célula de levadura se selecciona del grupo que consiste en: Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae, preferentemente la célula de levadura pertenece a la especie S. cerevisiae. 31. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 30 dónde la célula es la célula de levadura OVY216. 32. Construcción génica que comprende las secuencias nucleotídicas que codifican para: i) un promotor ii) un dominio de unión al ADN, y iii) la proteína heteróloga capaz de unirse a un péptido funcional localizado en el extremo C-terminal de la proteína de referencia. 33. Construcción génica según la reivindicación 26 donde el promotor es un promotor constitutivo, preferentemente el promotor de ADH1, el dominio de unión al ADN es preferentemente el dominio de unión de la proteína LexA, y la proteína heteróloga es preferentemente la proteína humana TSG101 que comprende la SEQ ID NO: 32. 34. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 32 a 33 caracterizada por que es un plásmido, preferentemente el plásmido pRS402- LexA-Tsg101 que comprende la secuencia SEQ ID NO: 30. 35. Construcción génica que comprende las secuencias nucleotídicas que codifican para: i) un promotor ii) un dominio de transactivación y iii) una proteína de referencia que en su extremo carboxilo terminal comprende la secuencia que codifica para el péptido funcional 3xPTAP de SEQ ID NO: 12. 36. Construcción génica según la reivindicación 35 donde el promotor es un promotor constitutivo, preferentemente el promotor de ADH1, el dominio de transactivación es preferentemente el dominio de transactivación del activador transcripcional Gal4, y la proteína de referencia que comprende en su extremo carboxilo terminal la secuencia que codifica para el péptido funcional 3xPTAP de SEQ ID NO: 12. 37. Construcción génica según las reivindicaciones 35 a 36 caracterizada por que es un plásmido, preferentemente el plásmido pACT2-GK-3xPTAP que comprende la secuencia SEQ ID NO: 14. 38. Construcción génica que comprende las secuencias nucleotídicas que codifican para: i) un promotor ii) un dominio de unión al ADN, y iii) una proteína diana a la que se une la proteína de referencia. 39. Construcción génica según la reivindicación 38 donde el promotor es un promotor constitutivo, preferentemente el promotor es el promotor de ADH1, el dominio de unión al ADN es preferentemente el del activador transcripcional Gal4, y la proteína diana. 40. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 39 caracterizada por que es un plásmido, preferentemente el plásmido PGBKT7- GKRP que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.