Resumen
Selective culture medium for yeasts with β -liase activity, methods of elaboration and use. The present invention relates to a culture medium for selecting and isolating yeasts capable of increasing the production of thiol aromas in wine fermentations on the basis of their activity β -liase. The culture medium of the invention includes, as the sole source of nitrogen, an s-conjugated cysteine compound. Yeasts having β -liase activity release nh3 from said cysteine-s-conjugated compound and, thus, obtain nitrogen to grow. The invention also includes a method for making the culture medium of the invention as well as two methods for using the culture medium: - in solid form for the selection and isolation of yeasts with β -liase activity, - in liquid form for the quantification of activity β - yeast yeast. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)
Reivindicaciones
1. REIVINDICACIONES 2. 1. Medio de cultivo selectivo para el aislamiento de levaduras con actividad J3-liasa que comprende: -una base nutritiva para levaduras sin aporte de nitrógeno, -un compuesto de cisteína-S-conjugado, -un cofactor para la enzima J3-liasa, en el que el compuesto de cisteína-S-conjugado es el único aporte de nitrógeno. 3. 2. Medio de cultivo selectivo según la reivindicación 1 cuyo pH tiene un valor de entre 3,0 y 4,0. 4. 3. Medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en el que la concentración final de la base nutritiva para levaduras sin aporte de nitrógeno es de 5 a 20 gIl. 5. 4. Medio de cultivo selectivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que incluye un agente inhibidor del crecimiento bacteriano. 6. 5. Medio de cultivo selectivo según la reivindicación 4 en el que el agente inhibidor del crecimiento bacteriano es cloranfenicol. 7. 6. Medio de cultivo selectivo según la reivindicación 5 en el que el cloranfenicol está a una concentración final de 50 mgll. 8. 7. Medio de cultivo selectivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la concentración final del compuesto de cisteína-S-conjugado es de 0,05 a 2 gIl. 9. 8. Medio de cultivo selectivo según la reivindicación 7 en el que el compuesto de cisteína-S-conjugado es sintético. 10. 9. Medio de cultivo selectivo según la reivindicación 8 en el que el compuesto sintético de cisteína-S-conjugado es la S-metil-L-cisteína. 11. 10. Medio de cultivo selectivo según cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en el que el compuesto de cisteína-S-conjugado está a una concentración final de 0,1 gIl. 12. 11. Medio de cultivo selectivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el cofactor para la enzima ¡3-liasa es piridoxal-5'-fosfato a una concentración final de 0,005 a 0,015 gIl. 13. 12. Medio de cultivo selectivo según la reivindicación 11 en el que el piridoxal-5' fosfato está a una concentración final de 0,01 gIl. 14. 13. Medio de cultivo selectivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que incluye un agente solidificante. 15. 14. Medio de cultivo selectivo según la reivindicación 13 en el que el agente solidificante es agar-agar a una concentración final de 15 a 20g/l. 16. 15. Método para elaborar un medio de cultivo selectivo para el aislamiento de levaduras con actividad ¡3-liasa que comprende los siguientes pasos: a) disolver en agua desionizada y por separado los siguientes componentes: 17. -base nutritiva para levaduras sin aporte de nitrógeno, -compuesto de cisteína-S-conjugado, -cofactor para la enzima ¡3-liasa, 18. b) esterilizar por filtración, con filtros de 0,22-0,45 IJm, cada una de las disoluciones del paso a); c) mezclar, en condiciones asépticas, todos los componentes del paso b). 19. 16. Método según la reivindicación 15 en el que, en el paso a), además, se ajusta el pH de cada disolución a un valor de entre 3,0 y 4,0 con HCI. 20. 17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15-16 en el que se incluyen los siguientes pasos: d) esterilizar en autoclave un agente solidificante disuelto en agua desionizada; e) atemperar el agente solidificante del paso d) hasta que alcance 50-55°C; f) mezclar, en condiciones asépticas, el agente solidificante del paso e) con la mezcla del paso c); g) distribuir el medio de cultivo del paso f) en placas de Petri, en condiciones asépticas, y dejar enfriar hasta que solidifique. 21. 18. Método según la reivindicación 17 en el que el agente solidificante que se añade es agar-agar a una concentración final de 15 a 20g/1 22. 19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15-18 en el que se añade un agente inhibidor del crecimiento bacteriano a la mezcla del paso c). 23. 20. Método según la reivindicación 19 en el que el inhibidor del crecimiento bacteriano es cloranfenicol. 24. 21. Método según la reivindicación 20 en el que el cloranfenicol se añade a una concentración final de 50 mgll. 25. 22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15-21 en el que la base nutritiva para levaduras se añade a concentración final de 5 a 20 gIl. 26. 23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15-22 en el que el compuesto de cisteína-S-conjugado es sintético. 27. 24. Método según la reivindicación 23 en el que el compuesto sintético es la S-metil L-cisteína. 28. 25. Método según la reivindicación 24 en el que el compuesto de cisteína-Sconjugado se añade a concentración final de 0,05 a 2 gIl 29. 26. Método según cualquiera de las reivindicaciones 25 en el que el conjugado de cisteína se añade a una concentración final de 0,1 gIl. 30. 27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15-26 en el que el cofactor para la enzima (3-liasa que se añade es piridoxal-5'-fosfato a una concentración final de 0,005 a 0,015 gIl. 31. 28. Método según la reivindicación 27 en el que el piridoxal-5' -fosfato se añade a una concentración final de 0,01 gIl. 32. 29. Método de selección y aislamiento de levaduras actividad (3-liasa que comprende: a) preparar una o varias muestras por filtrado o por centrifugación y lavado; b) extender la/s muestra/s sobre la superficie del medio de cultivo sólido definido en las reivindicaciones 13-14; c) incubar a 20-30°C durante 48-72 horas; d) seleccionar y aislar las colonias crecidas sobre el medio de cultivo. 33. 30. Método para determinar cuantitativamente la actividad r3-liasa de levaduras que incluye: a) inocular una levadura en un medio de cultivo líquido según se define en las 34. 5 reivindicaciones 1-12; b) incubar a 20-30°C durante 24-48 horas; c) detectar por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GCMS) el derivado tiólico volátil de la reacción de la r3-liasa.
