madrid2i

Resumen

Method and kit for the quantitative assessment of telomerase activity. The present invention relates to a method for the quantitative assessment of telomerase activity without the use of DNA amplification techniques, such as PCR. The method uses the primers defined by SEQ ID NO: 1 and 2 together with DNA polymerase, d-NTPs, a double-stranded DNA-specific intercalating agent, and the appropriate conditions for the telomerase in the sample to synthesize the G-strand of the telomere and DNA. polymerase to synthesize the C chain, its activity being measured by the specific intercalating agent for double-stranded DNA. Since DNA amplification is not performed, the DNA polymerase used may be thermolabile. The invention also relates to a kit for carrying out this method and to the uses of both. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Reivindicaciones

1. REIVINDICACIONES 1. Método para la valoración cuantitativa de la actividad de telomerasa que incluye los siguientes pasos: a) obtener extractos de las células que se quieren estudiar; b) desnaturalizar las proteínas de una parte alícuota del extracto obtenido en el paso a), que será usada como blanco; c) mezclar el extracto del paso a) con un tampón adecuado para que tenga lugar la reacción de telomerasa, losprimerdescritos en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, ADN polimerasa, MgCE d-NTPs y un agente intercalante específico de ADN bicatenario; d) mezclar la parte alícuota del extracto cuyas proteínas se han desnaturalizado en el paso b) con un tampón adecuado para que tenga lugar la reacción de telomerasa, losprimerdescritos en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, ADN polimerasa, MgCE d-NTPs y el mismo agente intercalante específico de ADN bicatenario que en el paso c); e) medir la fluorescencia del paso c) en el tiempo cero (T=0) y a los 30 minutos de iniciada la reacción (T=30), y medir la fluorescencia del paso d) en el tiempo cero (T=0) y a los 30 minutos de iniciada la reacción (T=30); f) calcular la diferencia entre la fluorescencia en T=30 yT=0 minutos del extracto a analizar (paso c) y del blanco (paso d); donde no se realiza ninguna amplificación del producto de la reacción de telomerasa por técnicas de reacción en cadena. 2. Método según la reivindicación 1 en el que el agente intercalante específico de ADN bicatenario es un colorante fluorogénico. 3. Método según la reivindicación 2 en el que el agente intercalante específico de ADN bicatenario es SYBR-Green I. 4.Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la reacción del paso e) se realiza a una temperatura entre 25 y 350C. 5. Método según la reivindicación4en el que la temperatura de reacción es de 300C. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el pH del tampón adecuado para que tenga lugar la reacción de telomerasa es de 8,3. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el producto de la reacción se valora directamente mediante un espectrofluorímetro. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la ADN polimerasa no es termoestable. 9. Kit para valorar la actividad de telomerasa de una muestra que incluye losprimersdefinidos por SEQ ID N O : 1 y SEQ ID NO: 2. 10. Kit según la reivindicación 9 que, además, incluye ADN polimerasa, MgCE d-NTPs y un agente intercalante específico de ADN bicatenario. 11. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 en el que el agente intercalante específico de ADN bicatenario es un colorante fluorogénico. 12. Kit según la reivindicación 11 en el que el colorante fluorogénico es SYBR-Greenl. 13. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9-12 en el que la ADN polimerasa no es termoestable. 14. Uso del método definido en las reivindicaciones 1-8 y/o del kit definido en las reivindicaciones 9-13 en el estudio de la capacidad de proliferación de las células, la identificación de fármacos y/o moléculas capaces de actuar como activadores o inhibidores de la actividad telomerásica, el estudio de terapias regenerativas frente al infarto de miocardio, la identificación de la proliferación tumoral asociada al cáncer, la detección del estado de malignidad de diferentes tipos de cáncer, la detección del grado de proliferación de células madre y/o el estudio del alargamiento de la vida.

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