madrid2i

Resumen

Use of the ncbsr4 gene for the diagnosis and prevention of neosporosis and as a marker for the analysis of pathogenesis. The present invention relates to the use of the ncbsr4 gene and the ncbsr4 protein, the expression vectors and the host cells that contain them, for the diagnosis and prevention of neosporosis and, as a specific marker of the bradyzoite phase of n. Caninum, for the analysis of the pathogenesis or efficacy of vaccines against the establishment of chronic infection in the intermediate host. It also refers to the use of the promoter of the ncbsr4 gene for the expression of heterologous genes that allows the study of the molecular mechanisms that determine the conversion of the stage from tachyzoite to bradyzoite and vice versa. In addition, the present invention relates to the development of monoclonal antibodies and monospecific polyclonal sera against the ncbsr4 protein and its recombinant form, which represent an alternative for the serological diagnosis of neosporosis and of chronic n. Caninum infection in animal tissues. . (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Reivindicaciones

1. 1. Molécula polinucleotídicacaracterizada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 13que contiene el gen NcBSR4 de Neospora caninum. 2. 2. Molécula polinucleotídica segúnreivindicación 1 caracterizada porque codifica la proteínaantigénica NcBSR4 de Neospora caninum (SEQ ID NO: 14) . 3. 3. Molécula polinucleotídica segúnreivindicación 1 caracterizada por la secuencia comprendidaentre el nucleótido 1084 y el 2195 de la secuencia SEQ ID NO:13. 4. 4. Molécula polinucleotídica seleccionada delconjunto de secuencias constituido por (a) el gen NcBSR4 deNeospora caninum, caracterizado por SEQ ID NO: 13, (b) secuencias homólogas al gen NcBSR4 que codifican el antígenoNcBSR4 y (c) fragmentos del gen NcBSR4 que codificanpolipéptidos que conservan las características antigénicas deNcBSR4. 5. 5. Procedimiento para el diagnóstico invitro de la infección crónica por N. caninum a partir detejidos o fluidos de animales infectados caracterizado por ladetección de las moléculas polinucleotídicas según lasreivindicaciones 1 a 4 mediante su amplificación enzimática basadaen la reacción PCT o RT-PCR, su hibridación insitu con sondas de DNA o cualquier otro método de detección delos ácidos nucleicos. 6. 6. Procedimiento para el diagnóstico de lainfección crónica por N. caninum según la reivindicación 5caracterizado por el uso deoligonucleótidos-cebadores y/o sondas elegidos delconjunto constituido por las secuencias SEQ ID NO: 1 (R1BSR4) , SEQID NO: 2 (R2BSR4) , SEQ ID NO: 3 (F1BSR4) , SEQ ID NO: 4 (F2BSR4) , SEQ ID NO: 5 (NcESTF) , SEQ ID NO: 6 (NcESTR) , SEQ ID NO: 7 (FNCEST5) , SEQ ID NO: 8 (RNCEST3) , SEQ ID NO: 9 (FBamHNcBSR4) , SEQID NO: 10 (RHindIIINcBSR4) , SEQ ID NO: 11 (NcBSR4F3) y SEQ ID NO:12 (NcBSR4R3) . 7. 7. Vector recombinante caracterizadoporque comprende una secuencia de nucleótidos definida según lasreivindicaciones 1 a 4. 8. 8. Vector recombinante caracterizadoporque comprende la molécula polinucleotídica según lareivindicación 3 y el plásmido pRSET-C. 9. 9. Células eucariotas hospedadoras transfectadascon los vectores recombinantes de la reivindicación 7. 10. 10. Células procariotas hospedadorastransformadas con los vectores recombinantes de la reivindicación 7u 8. 11. 11. Un polipéptido purificado o aisladoseleccionado de (a) la proteína antigénica NcBSR4 de N.caninum, caracterizada por la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 14; (b) secuencias modificadas química o enzimáticamentederivadas de secuencias homólogas a la de la proteína NcBSR4 (SEQID NO: 14) que conservan sus características antigénicas; (c) polipéptidos derivados de NcBSR4 (SEQ ID NO: 14) que conservan suscaracterísticas antigénicas; o (d) proteínas recombinantes quecomprenden la proteína NcBSR4 (SEQ ID NO: 14) o polipéptidosderivados de NcBSR4 (SEQ ID NO: 14) que conservan suscaracterísticas antigénicas. 12. 12. Procedimiento para el diagnóstico serológicode la infección crónica por N. caninum caracterizadopor el uso de anticuerpos monoclonales o suero policlonal específicofrente a proteínas y/o polipéptidos según la reivindicación 11mediante inmunohistoquímica, inmunofluorescencia o cualquier otrométodo basado en la detección de dichas proteínas y/o polipéptidospor el citado suero. 13. 13. Procedimiento para el diagnóstico serológicode la infección crónica por N. caninum caracterizadopor la detección de las proteínas y/o polipéptidos según lareivindicación 11 mediante enzimoinmunoanálisis (ELISA) , radioinmunoanálisis (RIA) , inmunoblot o cualquier otro métodobasado en la capacidad antigénica de dichos polipéptidos. 14. 14. Procedimiento para el diagnóstico serológicode la infección crónica por N. caninum según lareivindicación 13 caracterizado por la detección de lasproteínas y/o polipéptidos según la reivindicación 11 mediante unELISA de competición. 15. 15. Una composición inmunogénica que comprenda: (a) un polipéptido según la reivindicación 11, (b) un a moléculapolinucleotídica según las reivindicaciones 1 a 4; (c) un vectorrecombinante según la reivindicación 7; (d) unas célulashospedadoras transfectadas según las reivindicaciones 9; (e) unascélulas hospedadoras transformadas según las reivindicaciones 10, formulada como vacuna contra la neosporosis. 16. 16. Una composición inmunogénica según lareivindicación 15, que comprenda un adyuvante o una o variascitoquinas. 17. 17. Un método de preparación de una composicióninmunogénica que comprenda una combinación de (a) un polipéptidosegún la reivindicación 11; (b) una molécula polinucleotídica quecontenga una secuencia que codifique un polipéptido según lareivindicación 11; (c) un vector recombinante según lareivindicación 7; (d) unas células hospedadoras transfectadas segúnlas reivindicaciones 9; (e) unas células hospedadoras transformadassegún las reivindicaciones 10, formulada como vacuna contra laneosporosis. 18. 18. Un kit de vacunación para mamíferos contrala neosporosis que comprenda un contenedor que incluya unacomposición inmunogénica formulada según reivindicaciones 15 y16.

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