Reivindicaciones
1. REIVINDICACIONES 2. 1. Método para la detección y/o cuantificación de AON de caballo en muestras aisladas que incluye: 3. 5 a. -unir al menos una molécula de una sonda con una secuencia diana específica de AON o de ARN a partículas magnéticas; 4. b. -poner en contacto las partículas magnéticas del paso a. con la/s muestra/s en las que se desea detectar y/o cuantificar el AON de caballo; 5. c. - incubar las partículas magnéticas del paso b. con un anticuerpo detector, o un 6. 10 fragmento de anticuerpo detector, específico antihomoduplex AON/AON o antiheteroduplex ARN/AON ; 7. d. -incubar las partículas magnéticas del paso c. con una proteína bacteriana con capacidad de unión a la región Fc del anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, conjugada con una molécula de generación y amplificación de la respuesta 8. 15 electroquímica; 9. e. -capturar las partículas magnéticas del paso d. sobre electrodos impresos de trabajo colocados en soportes magnéticos; donde la sonda del paso a. tiene una longitud de entre 15 y 144 pb Y está comprendida en SEO ID NO: 2, la secuencia inversa a SEO ID NO: 2, la 10. 20 transcripción a ARN de cualquiera de las dos anteriores, o secuencias con un 98% de identidad con cualquiera de las cuatro anteriores. 11. 2. Método según la reivindicación 1 en el que las muestras del paso b. son muestras de AON mitocondrial extraído. 12. 3. Método según la reivindicación 1 en el que las muestras del paso b. son lisados mitocondriales sin extracción del AON . 13. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que los pasos c. 30 y d. se realizan simultáneamente. 14. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que los pasos b. c y d se realizan simultáneamente. 15. 35 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las partículas magnéticas son nanopartículas o micropartículas. 16. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las partículas magnéticas tienen propiedades superparamagnéticas. 17. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la unión de 18. 5 la secuencia diana específica de AON o de ARN a las partículas magnéticas se realiza con : -un primer elemento de unión con el que se modifican las partículas magnéticas: biotina, proteínas de unión a análogos de biotina, grupos COOH, grupos tosilo y/o secuencias específicas de AON ; 19. 10 -un segundo elemento de unión de la sonda de AON o de ARN a las partículas magnéticas modificadas: biotina, análogos de biotina, grupos amino y/o bases complementarias a las secuencias específicas de AON. 20. 9. Método según la reivindicación 8 en el que las proteínas de unión a análogos de 21. 15 biotina se seleccionan del grupo: estreptavidina, avidina, espiavidina, neutravidina, traptavidina y/o anticuerpos antibiotina. 22. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8-9 en el que las secuencias 23. específicas de AON son secuencias de entre 4 y 30 adeninas (A) o entre 4 y 30 20 timinas (T). 24. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8-10 en el que los análogos de biotina se seleccionan del grupo: digoxigenina, biotinpropanol, moléculas de biotina marcadas con fluoresceína. 25. 12. Método según la reivindicación 8 en el que el primer elemento de unión es estreptavidina y el segundo elemento de unión es biotina. 26. 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la proteína 27. 30 bacteriana con capacidad de unión a la región Fc del anticuerpo detector, o fragmento de anticuerpo detector, es la proteína G o la proteína A. 28. 14. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la molécula 29. de generación y amplificación de la respuesta electroquímica es HRP, poli-HRP o 35 fosfatasa alcalina. 30. 15. Método según las reivindicaciones 13-14 en el que la proteína bacteriana es Prot A y la molécula de generación y amplificación de la respuesta electroquímica es poliHRP40. 31. 16. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la sonda está caracterizada por SEO ID NO: 3 o por SEO ID NO: 4. 32. 17. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el electrodo de trabajo está realizado con un material seleccionado del grupo: oro, carbono, platino, CO-trodos, electrodos impresos, plata, mercurio, grafito, carbón vítreo, nanotubos de carbono, nanocables de oro, nanopartículas de oro, nanopartículas de óxido metálico, pasta de carbono, diamante y compuestos dopados con boro. 33. 18. Método según la reivindicación 17 en el que el electrodo es un electrodo de trabajo impreso de carbono. 34. 19. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el soporte magnético incluye un imán de neodimio. 35. 20. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el soporte magnético incluye un imán embebido en la propia estructura del soporte magnético. 36. 21. Kit para detectar y/o cuantificar la presencia de AON de caballo en muestras aisladas que incluye: -partículas magnéticas modificadas con un primer elemento de unión al que se une al menos una molécula de una sonda de AON o de ARN por medio de un segundo elemento de unión; -un anticuerpo detector, o un fragmento de anticuerpo detector, específico antihomoduplex AON/AON o antiheteroduplex ARN/AON; -una proteína bacteriana con capacidad de unión a la región Fc del anticuerpo detector, o fragmento de anticuerpo detector, conjugada con una molécula de generación y amplificación de la respuesta electroquímica; -y un electrodo impreso de trabajo sobre un soporte magnético; en el que la sonda tiene una longitud de entre 15 y 144 pb Y está comprendida en SEO ID NO: 2, la secuencia inversa a SEO ID NO: 2, la transcripción a ARN de cualquiera de las dos anteriores, o secuencias con un 98% de identidad con cualquiera de las cuatro anteriores. 37. 22. Kit según la reivindicación 21 en el que las partículas magnéticas son nanopartículas o micro partículas. 38. 23. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21-22 en el que las partículas magnéticas tienen propiedades superparamagnéticas. 39. 24. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21-23 en el que el primer elemento de unión con el que se modifican las partículas magnéticas es biotina, proteínas de unión a análogos de biotina, grupos COOH, grupos tosilo y/o secuencias específicas deAON. 40. 25. Kit según la reivindicación 24 en el que las proteínas de unión a análogos de biotina se seleccionan del grupo: estreptavidina, avidina, espiavidina, neutravidina, traptavidina y/o anticuerpos antibiotina. 41. 26. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 24-25 en el que las secuencias específicas de AON son secuencias de entre 4 y 30 adeninas (A) o entre 4 y 30 timinas (T). 42. 27. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21-26 en el que el segundo elemento de unión de la sonda de AON o de ARN a las partículas magnéticas modificadas es biotina, análogos de biotina, grupos amino y/o bases complementarias a las secuencias específicas de AON . 43. 28. Kit según la reivindicación 27 en el que los análogos de biotina se seleccionan del grupo: digoxigenina, biotinpropanol, moléculas de biotina marcadas con fluoresceína. 44. 29. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21-23 en el que el primer elemento de unión es estreptavidina y el segundo elemento de unión es biotina. 45. 30. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21-29 en el que la proteína bacteriana con capacidad de unión a la región Fc del anticuerpo detector, o fragmento de anticuerpo detector, es la proteína G o la proteína A. 46. 31 . Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21-30 en el que la molécula de generación y amplificación de la señal es HRP, poli-HRP o fosfatasa alcalina. 47. 32. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21-31 en el que la sonda está caracterizada por SEO ID NO: 3 y SEO ID NO: 4. 48. 33. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21-32 en el que el electrodo de trabajo está realizado con un material seleccionado del grupo: oro, carbono, platino, CO-trodos, electrodos impresos, plata, mercurio, grafito, carbón vítreo, nanotubos de carbono, nanocables de oro, nanopartículas de oro, nanopartículas de óxido metálico, pasta de carbono, diamante y compuestos dopados con boro. 49. 34. Kit según la reivindicación 33 en el que el electrodo es un electrodo impreso de carbono. 50. 35. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 21-34 en el que el soporte magnético incluye un imán de neodimio. 51. 36. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 33-35 en el que el soporte magnético incluye un imán embebido en la propia estructura del soporte magnético. 52. 37. Kit para detectar y/o cuantificar la presencia de AON de caballo en muestras aisladas que incluye: -micropartículas magnéticas modificadas con estreptavidina a las que se une una sonda caracterizada por SEO ID NO: 3 o 4 y modificada con biotina; -un anticuerpo detector, o fragmento de anticuerpo detector, específico antiheteroduplex ARN/AON; -una proteína bacteriana Prot A conjugada con poli-HRP20, poli-HRP40 o poli HRP80; -Y un electrodo impreso de trabajo sobre un soporte magnético que incluye un imán unido al soporte magnético o embebido en su estructura. 53. 38. Uso del kit definido en las reivindicaciones 21-37 en la detección y/o cuantificación de la presencia de carne de caballo en mezclas de carne. 54. Fig.1 55. 144bp 56. B. M. H. M. B. M. H. M. H. M. 57. • , 58. A B e 59. Fig.2 60. 40 8000 61. r 30 62. lt;C 63. r 20 al 64. e 65. CI) 66. - 67. -4000 68. '1 69. ,.. 10 70. oo 71. bRNACp-24bp bRNACp-40bp 72. Fig.3 73. 1 2 3 74. Fig. 4 75. ~.------------------#--------------~ 76. lt;C 77. e 4000 78. .-... I 79. [SEQ ID NO: 1], nM 80. Fig.5 1800 1500 1200 « 900 81. c: 82. - 83. quot;, 600 300 84. O 85. 5 10 50 100 250 86. n9 AONrnt 87. · 88. :i 89. 6 -· 90. al 91. :i 92. 4 · 93. ~ 94. O 95. 500 750 96. Fig.7 97. « 800 98. e 99. ''i' ~ 100. Fig.8 101. ! 102. , 103. 1000« 750- 104. I 105. e 106. ''i' ~ 107. • 108. 500· 109. • 110. • 111. • 112. 250· 113. • • 114. ., 115. O 116. 0' 117. 0,1 1 10 100 118. % 119. Fig.9a 120. 300 -T 121. T 122. l. 123. lt; 124. ... 125. C~ 150 -T 126. quot;¡ 127. o I I I 128. o 0.5 1.0 129. % 130. Fig.9b 131. 700 600 500 132. lt; 133. e 134. 'jquot; ~ 135. 300 200 136. O 137. O 2 4 6 8 10 %
