Resumen
Biocatalyst with nucleoside deoxyribosyltransferase activity immobilized on magnetic particles of chitosan. The invention relates to a new biocatalyst based on the covalent immobilization of the nucleoside 2'-deoxyribosyltransferase of lactobacillus reuteri in magnetic particles obtained from chitosan and fe3 o4 (magnetite). Also, the invention relates to the process for making said biocatalyst and to the process for its use in the synthesis of different nucleosides of therapeutic interest such as ara-a, ara-c, 2'-fluoro-2'-deoxyadenosine and 2'-fluoro- 2'-deoxycytidine. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)
Reivindicaciones
1. Reivindicaciones 2. 1. Biocatalizador inmovilizado que comprende la enzima nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasa inmovilizada covalentemente en partículas sólidas elaboradas a partir de magnetita (Fe304) atrapada en quitosano. 3. 2. Biocatalizador inmovilizado según la reivindicación 1 en el que las partículas sólidas elaboradas a partir de magnetita (Fe304) atrapada en quitosano están activadas con glutaraldehído. 4. 3. Biocatalizador inmovilizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en que la nucleósido 2'-desoxirribosil-transferasa es de origen procariota. 5. 4. Biocatalizador inmovilizado según la reivindicación 3 en que la enzima inmovilizada es la nucleósido 2'-desoxirribosil-transferasa de Lactobacillus reuteri, caracterizada por SEQ ID NO: 2, o un polipéptido cuya secuencia tiene, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO: 2 y conserva su actividad nucleósido 2'-desoxirribosil-transferasa. 6. 5. Biocatalizador inmovilizado según la reivindicación 4 en que la nucleósido 2'desoxirribosil-transferasa es una enzima recombinante. 7. 6. Biocatalizador inmovilizado según la reivindicación 5 en que la nucleósido 2'desoxirribosil-transferasa recombinante procede de la expresión del gen ndt de L. reuteri, caracterizado por SEQ ID NO: 1, o de una secuencia con, al menos, un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1, recombinante en Escherichia coli. 8. 7. Procedimiento para la preparación del biocatalizador inmovilizado definido en las reivindicaciones anteriores que comprende: (a) el atrapamiento de magnetita en una matriz polimérica de quitosano, (b) el entrecruzamiento de las cadenas poliméricas de quitosano, 9. (c) la activación de las partículas magnéticas, (d) la unión de la enzima nucleósido 2'desoxirribosil-transferasa a las partículas magnéticas obtenidas en el paso (c). 10. 8. Procedimiento según la reivindicación 7 en el que el paso (a) incluye la preparación de una solución de quitosano al 3% en ácido acético en la que se dispersa homogéneamente un 25-50% de magnetita, con respecto a la cantidad de quitosano; la adición de la suspensión resultante a una solución de NaOH mediante goteo; y la agitación de las partículas obtenidas durante 0,5-3 horas en la solución de NaOH. 11. 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-8 en que el paso (b) se realiza con epiclorhidrina al 2-5% a 50°C. 12. 10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en e! que e! paso (c) incluye la incubación de las partículas magnéticas en una solución tamponada de glutaraldehído a 25°C. 13. 11. Procedimiento según la reivindicación lOen que la concentración de glutaraldehído en solución tamponada es del 2,5%. 14. 12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-11 en el que el paso (d) incluye poner en contacto 11-70 Ilg de nucleósido 2'-desoxirribosil-transferasa purificada con 17-50 mg de las partículas magnéticas del paso (c). 15. 13. Procedimiento según la reivindicación 12 en e! que la nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasa se pone en contacto con las partículas magnéticas del paso (c) a pH 7 Y durante 2-5 horas a 25°C. 16. 14. Procedimiento para la producción de nucleósidos naturales y no naturales mediante una reacción enzimática de transglicosilación en un solo paso, entre un nucleósido donador de residuos glicosilados (que contiene una base púrica y/o pirimidínica) y una base nitrogenada aceptora de residuos glicosilados, que comprende e! uso del biocatalizador definido en las reivindicaciones 1-6. 17. 15. Procedimiento según la reivindicación 14 en que el residuo glicosilado de! nucleósido donador es p-D-arabinosa, 2'-desoxi-p-D-ribosa o 2'-fluoro-2'-desoxi-p-D-ribosa, y la base aceptora es citosina o adenina. 18. 16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-15 en que la reacción se realiza a 40°C. 19. 5 17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-16 en que la reacción se realiza a pH 6,5. 20. 18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-17 en que, tras la conclusión de la reacción, el biocatalizador inmovilizado se separa de la mezcla de 21. 10 reacción mediante aplicación de un campo magnético, filtración, decantación o centrifugación, y es reutilizable en reacciones de transglicosilación sucesivas. 22. 19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-18 en que el nucleósido producido está incluido en el siguiente grupo: 2'-desoxiadenosina; arabinosil-nucleósidos 23. 15 como el arabinósido de adenina (ara-A) y el arabinósido de citosina (ara-C); 2'-fluoro-2'desoxiribonucleósidos como la 2'-fluoro-2' -desoxiadenosina y la 2'-fluoro-2' desoxicitidina. 24. SEQUENCE LISTING 25. <110> Universidad Complutense de Madrid 26. <120> Biocatalizador con actividad nucleósido desoxriribosiltransferasa inmovilizado sobre partículas magnéticas de quitosano 27. <130> 01_2012 28. <160> 2 29. <170> BiSSAP 1.0 30. <210> 1 31. <211> 483 32. <212> DNA 33. <213> Lactobacillus reuteri 34. <220> 35. <221> source 36. <222> 1..483 37. <223> /mol_type="DNA" /organism="Lactobacillus reuteri" 38. <220> 39. <221> CDS 40. <222> 1..480 41. <223> /transl_table=11 42. /translation="MINQKSKTVYFCAGWFTDKQNKAYEDAMNAIKANPTVDVENSYVPLQHQYK 43. GLRVDEHPELLQDREWSTATYNGDRVGVSTSDMLLAVYIPEEEDVGMGVELGMARALGKYIMVVI PDEDFGKPINLMSWGIADNFIKMSELPNDYFNKPSYNFYDGGVY" 44. <400> 1 atgataaatc aaaaaagtaa gacagtatat ttctgtgccg ggtggtttac tgacaagcaa 60 45. aataaagctt atgaggatgc aatgaatgca attaaggcta accctacagt agatgtagag 120 46. aattcttatg tgccattaca acaccaatat aaaggattac gggttgatga acatccagag 180 47. cttttgcaag atcgcgaatg gagtacagca acttacaatg gtgatcgagt aggcgtttca 240 48. acttctgata tgcttttagc agtctacatt cctgaagaag aagatgtagg aatgggtgtt 300 49. gaattaggaa tggcacgcgc actaggtaaa tatattatgg tagtgattcc tgatgaggac 360 50. tttggtaaac caattaattt aatgagttgg ggaattgcag ataatttcat taaaatgtca 420 51. gaacttccta atgattactt taataaacca tcttataatt tctacgatgg tggagtatat 480 52. taa 483 53. <210> 2 54. <211> 160 55. <212> PRT 56. <213> Lactobacillus reuteri 57. <220> 58. <221> SOURCE 59. <222> 1..160 60. <223> /mol_type="protein" /note="[CDS]:1..480 from SEQ ID NO 1" /organism="Lactobacillus reuteri" 61. <400> 2 Met Ile Asn Gln Lys Ser Lys Thr Val Tyr Phe Cys Ala Gly Trp Phe 15 10 15 Thr Asp Lys Gln Asn Lys Ala Tyr Glu Asp Ala Met Asn Ala Ile Lys 62. 20 25 30 Ala Asn Pro Thr Val Asp Val Glu Asn Ser Tyr Val Pro Leu Gln His 35 40 45 Gln Tyr Lys Gly Leu Arg Val Asp Glu His Pro Glu Leu Leu Gln Asp 63. 50 55 60 64. Arg Glu Trp Ser Thr Ala Thr Tyr Asn Gly Asp Arg Val Gly Val Ser 65. 65 70 75 80 66. Thr Ser Asp Met Leu Leu Ala Val Tyr Ile Pro Glu Glu Glu Asp Val 67. 85 90 95 Gly Met Gly Val Glu Leu Gly Met Ala Arg Ala Leu Gly Lys Tyr Ile 100 105 110 Met Val Val Ile Pro Asp Glu Asp Phe Gly Lys Pro Ile Asn Leu Met 115 120 125 Ser Trp Gly Ile Ala Asp Asn Phe Ile Lys Met Ser Glu Leu Pro Asn 68. 130 135 140 Asp Tyr Phe Asn Lys Pro Ser Tyr Asn Phe Tyr Asp Gly Gly Val Tyr 145 150 155 160
