madrid2i

Resumen

The invention relates to probes capable of detecting specifically of microorganisms of the genera klebsiella and raoultella and of the genera enterobacter and pantoea. These probes can be used for the detection of said microorganisms in biological samples as well as biofilms that appear in the machinery used in the paper industry. Additionally, the probes are useful for the identification of compounds useful in the elimination of biofilms. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Reivindicaciones

1. 1. Un oligonucleótido que hibridaespecíficamente con el ADNr 16S de especies de los génerosKlebsiella y Raoultella. 2. 2. Un oligonucleótido según la reivindicación 1que comprende la secuencia correspondiente a las posiciones434-452 del ADN de los polinucleótidos definidos enSEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 o una variante funcionalmente equivalentede la misma. 3. 3. Un oligonucleótido según la reivindicación 2que consiste en la secuencia SEQ ID NO:3. 4. 4. Una sonda que comprende un oligonucleótidosegún cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 acoplado a unmarcador fluorescente. 5. 5. Una sonda según la reivindicación 4 en la queel resto fluorescente se selecciona del grupo de isotiocianato defluoresceína (FITC) , hexaclorofluoresceina (HEX) y CY3. 6. 6. Un oligonucleótido que hibridaespecíficamente con el ADNr 16S de especies de los génerosEnterobacter y Pantoea. 7. 7. Un oligonucleótido según la reivindicación 6que comprende la secuencia correspondiente a las posiciones442-457 del ADN del polinucleótido definido en SEQID NO:4 o una variante funcionalmente equivalente de la misma. 8. 8. Un oligonucleótido según la reivindicación 7que consiste en la secuencia SEQ ID NO:5. 9. 9. Una sonda que comprende un oligonucleótidosegún cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 acoplado a unamarcador fluorescente. 10. 10. Una sonda según la reivindicación 9 en laque el resto fluorescente se selecciona del grupo de isotiocianatode fluoresceína (FITC) , hexaclorofluoresceina (HEX) y CY3. 11. 11. Una sonda que comprende un oligonucleótidoque hibrida específicamente con la región repetitiva intergénicaconsenso (ERIC) de organismos de la familiaEnterobacteriaceae acoplado a un resto fluorescente. 12. 12. Una sonda según la reivindicación 11 en elque oligonucleótido que hibrida específicamente con la regiónrepetitiva intergénica consenso (ERIC) de organismos de la familiaEnterobacteriaceae comprende la secuencia SEQ ID NO:6. 13. 13. Una sonda según la reivindicación 12 en elque oligonucleótido consiste en la secuencia SEQ ID NO:6. 14. 14. Una sonda según cualquiera de lasreivindicaciones 11 a 13 en la que el resto fluorescente seselecciona del grupo de isotiocianato de fluoresceína (FITC) , hexaclorofluoresceina (HEX) y CY3. 15. 15. Uso de al menos un oligonucleótido según lasreivindicaciones 1 a 3 y 6 a 8 o de una sonda según cualquiera delas reivindicaciones 4, 5 y 9 a 14 para la detección deenterobacterias. 16. 16. Uso según la reivindicación 15 en el que lasenterobacterias pertenecen a un género seleccionado del grupo deKlebsiella, Raoultella, Enterobacter, yPantoea. 17. 17. Método para la detección de enterobacteriaspertenecientes a los géneros Klebsiella y Raoultella, que comprende 18. (a) poner en contacto la muestra que sesospecha contiene dichas enterobacterias con al menos una sondasegún las reivindicaciones 4 ó 5 en condiciones adecuadas para lahibridación de las sondas con los microorganismos pertenecientes adichos géneros. 19. (b) detectar la fluorescencia emitida porlas moléculas de oligonucleótido que han hibridado con lamuestra. 20. 18. Método para la detección de enterobacteriaspertenecientes al género Raoultella en una muestra quecomprende 21. (a) poner en contacto la muestra que sesospecha contiene dichas enterobacterias con al menos una sondasegún las reivindicaciones 4 ó 5 y con una sonda específica paralos microorganismos del género Klebsiella, en condicionesadecuadas para la hibridación de las sondas con los microorganismospertenecientes a dichos géneros y 22. (b) detectar la fluorescencia emitida porlas moléculas de oligonucleótidos que han hibridado con lamuestra 23. 19. Método según la reivindicación 18 en el quela sonda específica del género Klebsiella comprende unoligonucleótido que comprende o consiste en la secuencia SEQ IDNO:8 acoplada a un marcador fluorescente. 24. 20. Método para la detección en una muestra deenterobacterias pertenecientes a los géneros Enterobacter yPantoea que comprende 25. (a) poner en contacto la muestra que sesospecha contiene dichas enterobacterias con al menos una sondasegún las reivindicaciones 9 ó 10 en condiciones adecuadas para lahibridación de las sondas con los microorganismos pertenecientes adichos géneros. 26. (b) detectar la fluorescencia emitida porlas moléculas de oligonucleótido que han hibridado con la muestraen donde los microorganismos pertenecientes a los génerosEnterobacter y Pantoea son aquellos marcados con almenos una sonda según las reivindicaciones 9 ó 10. 27. 21. Método para la detección en una muestra deEnterobacter aerogenes Bac que comprende 28. (a) poner en contacto la muestra que sesospecha contiene Enterobacter aerogenes con al menos unasonda según las reivindicaciones 4 ó 5 y con al menos una sondasegún las reivindicaciones 9 ó 10 en condiciones adecuadas para lahibridación de las sondas con los microorganismos pertenecientes adichos géneros y 29. (b) detectar la fluorescencia emitida porlas moléculas de oligonucleótido que han hibridado con la muestraen donde los microorganismos pertenecientes a la especieEnterobacter aerogenes Bac son aquellos marcadossimultáneamente con al menos una sonda según las reivindicaciones 4ó 5 y con al menos una sonda según las reivindicaciones 9 ó10. 30. 22. Método según cualquiera de lasreivindicaciones 17 a 21 que comprende, adicionalmente, determinarla viabilidad celular. 31. 23. Método según la reivindicación 22 en el quela viabilidad celular se determina usando un colorante deexclusión. 32. 24. Método según la reivindicación 23 en el queel colorante de exclusión es ioduro de propidio. 33. 25. Método según cualquiera de lasreivindicaciones 17 a 24 que comprende adicionalmente ladeterminación del número total de células. 34. 26. Método según la reivindicación 25 en el quela determinación del número total de células en la muestra seefectúa mediante el uso de un compuesto seleccionado del grupode 35. (a) unagente que proporciona una señal fluorescente en presencia de ADNde cadena doble y 36. (b) unasonda capaz de hibridar específicamente con el ADNr 16S de todaslos organismos del superreino bacteria. 37. 27. Método según la reivindicación 26 en el queel agente que proporciona una señal fluorescente en presencia deADN de cadena doble es DAPI o SYTO13. 38. 28. Método según la reivindicación 26 en el quela sonda capaz de hibridar específicamente con el ADNr 16S de todoslos microorganismos comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7. 39. 29. Método según cualquiera de lasreivindicaciones 17 a 28 en el que la muestra de bacterias seencuentra inmovilizada en un soporte. 40. 30. Método según la reivindicación 29 en el queel soporte es una biopelícula. 41. 31. Método según la reivindicación 29 en el quela muestra que contiene bacterias inmovilizadas se ha obtenidomediante la inmovilización de bacterias en suspensión. 42. 32. Método según cualquiera de lasreivindicaciones 17 a 31 en el que la determinación de las célulascuyo ADN hibrida con al menos uno de los oligonucleótidos y/o ladeterminación del número de células totales se determina mediantecitometría de flujo o mediante hibridación fluorescente insitu. 43. 33. Método para la caracterización de unapoblación bacteriana que comprende 44. (a) poner en contacto dicha poblaciónbacteriana con un oligonucleótido según cualquiera de lasreivindicaciones 1 a 3 y 45. (b) determinar el número de células cuyoADN hibrida específicamente con dicho oligonucleótido y el númerototal de células en donde el porcentaje de células positivas cuyoADN hibrida con el oligonucleótido con respecto al número decélulas totales indica el porcentaje de bacterias de los génerosKlebsiella y Raoultella en la muestra. 46. 34. Método según la reivindicación 33 en el quela población bacteriana se pone en contacto en la etapa (a) adicionalmente con un oligonucleótido según cualquiera de lasreivindicaciones 6 a 8 en donde el porcentaje de células positivaspara dicho oligonucleótido con respecto al número de célulastotales indica el porcentaje de bacterias de los génerosEnterobacter y Pantoea. 47. 35. Método para la caracterización de unapoblación bacteriana que comprende 48. (a) poner en contacto dicha poblaciónbacteriana con un oligonucleótido según cualquiera de lasreivindicaciones 6 a 8 y 49. (b) determinar el número de células cuyoADN hibrida específicamente con dicho oligonucleótido sonda y elnúmero total de células 50. 36. Método según la reivindicación 35 en el quela población bacteriana se pone en contacto en la etapa (a) adicionalmente con un oligonucleótido según cualquiera de lasreivindicaciones 1 a 3 en donde el porcentaje de células positivaspara dicho oligonucleótido con respecto al número de célulastotales indica el porcentaje de bacterias de los génerosKlebsiella y Raoultella. 51. 37. Método según cualquiera de lasreivindicaciones 33 a 36 en el que la población bacteriana se poneen contacto en la etapa (a) adicionalmente con un oligonucleótidoque hibrida específicamente con la región repetitiva intergénicaconsenso (ERIC) de organismos de la familiaEnterobacteriaceae. 52. 38. Método según la reivindicación 37 en el queel oligonucleótido que hibrida específicamente con la regiónrepetitiva intergénica consenso (ERIC) de organismos de la familiaEnterobacteriaceae comprende la secuencia SEQ ID NO:6. 53. 39. Método según la reivindicación 37 en el queoligonucleótido que hibrida específicamente con la regiónintergénica repetitiva consenso (ERIC) de organismos de la familiaEnterobacteriaceae consiste en la secuencia SEQ ID NO:6. 54. 40. Método según cualquiera de lasreivindicaciones 33 a 39 en el que el oligonucleótido según lasreivindicaciones 1 a 3 está marcado con un primer colorantefluorescente, el oligonucleótido según las reivindicaciones 4 a 6está marcado con un segundo marcador fluorescente y eloligonucleótido que hibrida específicamente con la regiónintergénica repetitiva consenso (ERIC) de microorganismos de lafamilia Enterobacteriaceae está marcado con un tercermarcador fluorescente. 55. 41. Método según cualquiera de lasreivindicaciones 33 a 40 en el que la determinación del número decélulas cuyo ADN hibrida con cada uno de los oligonucleótidos selleva a cabo mediante hibridación fluorescente in situ. 56. 42. Método según cualquiera de lasreivindicaciones 33 a 41 en el que la determinación del númerototal de células en la muestra se efectúa mediante el uso de uncompuesto seleccionado del grupo de 57. (a) unagente que proporciona una señal fluorescente en presencia de ADNde cadena doble y 58. (b) unasonda capaz de hibridar específicamente con el ADN 16S de todas losorganismos del superreino bacteria. 59. 43. Método según la reivindicación 42 en el queel agente que proporciona una señal fluorescente en presencia deADN de cadena doble es DAPI o SYTO13. 60. 44. Método según la reivindicación 42 en el quela sonda capaz de hibridar específicamente con el ADNr 16S de todoslos microorganismos comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7. 61. 45. Método según cualquiera de lasreivindicaciones 33 a 41 en el que la determinación del númerototal de células se lleva a cabo mediante hibridación fluorescentein situ o mediante citometría de flujo. 62. 46. Método según cualquiera de lasreivindicaciones 33 a 45 en el que la muestra de bacterias seencuentra inmovilizada en un soporte. 63. 47. Método según la reivindicación 46 en el queel soporte es una biopelícula. 64. 48. Método según la reivindicación 46 en el quela muestra que contiene bacterias inmovilizadas se ha obtenidomediante la inmovilización de bacterias en suspensión. 65. 49. Método para determinar la eficacia de untratamiento antibacteriano sobre las enterobacterias que forman unabiopelícula que comprende las etapas de 66. (a) someter la biopelícula a untratamiento antibacteriano 67. (b) poner en contacto dicha biopelículacon al menos una sonda según se define en las reivindicaciones 11 a14 y 68. (c) determinar el porcentaje de célulaspositivas para la sonda o sondas aplicada o aplicadas en la etapa (b) con respecto el número total de células 69. 50. Método según la reivindicación 49 en el quela determinación del número total de células en la muestra seefectúa mediante el uso de un agente que proporciona una señalfluorescente en presencia de ADN de cadena doble. 70. 51. Método según la reivindicación 50 en el queel agente que proporciona una señal fluorescente en presencia deADN de cadena doble es DAPI. 71. 52. Método según la reivindicación 51 en el quela determinación del número total de células en la muestra seefectúa mediante el uso de una sonda capaz de hibridarespecíficamente con el ADN 16S de todas los organismos delsuperreino Bacteria. 72. 53. Método según la reivindicación 52 en el quela sonda capaz de hibridar específicamente con el ADN 16S de todoslos organismos del superreino bacteria contiene o comprende lasecuencia SEQ ID NO:7. 73. 54. Método según las reivindicaciones 49 a 53 enel que la determinación del número de células positivas para lassondas aplicadas en la etapa (b) y el número de células totales sedetermina mediante hibridación fluorescente in situ.

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