Thermostable polypeptide with esterase activity, variants thereof and their applications. A thermostable polypeptide with esterase activity based on esterase i of pseudomonas fluorescens (pfei) and its applications is described. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)
1. REIVINDICACIONES 2. 1. Un polipéptido con actividad esterasa, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, y, al menos, una mutación puntual que consiste en la sustitución de un aminoácido presente en dicha secuencia por otro aminoácido, en donde dicha mutación presente en dicha secuencia SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo formado por: 3. (i) una mutación puntual en el aminoácido glutamina (Q) localizado en la posición 11 de SEQ ID NO: 1, en donde dicha glutamina es substituida por el aminoácido Leucina (L) [Q11L], 4. (ii) una mutación puntual en el aminoácido alanina (A) localizado en la posición 191 de SEQ ID NO: 1, en donde dicha alanina es substituida por el aminoácido serina (S) [A191S], y 5. (iii) una mutación puntual en el aminoácido ácido aspártico (D) localizado en la posición 212 de SEQ ID NO: 1, en donde dicho ácido aspártico es substituido por el aminoácido tirosina (Y) [D212Y], 6. (iv) y cualquier combinación de las mismas; 7. o una variante funcionalmente equivalente de dicho polipéptido. 8. 2. Polipéptido según la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido es estable a una temperatura comprendida entre 60ºC y 95ºC. 9. 3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicho polipéptido tiene una vida media de más de 33 minutos a 65ºC. 10. 4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho polipéptido tiene una temperatura de desnaturalización (Tm) mayor de 71ºC, determinada en ausencia de un agente caotrópico. 11. 5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho polipéptido tiene una temperatura de desnaturalización (Tm) mayor de 71ºC, determinada en presencia de cloruro de guanidinio 62,5 mM como un agente caotrópico. 12. 6. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho polipéptido es estable en un disolvente orgánico polar aprótico. 13. 7. Polipéptido según la reivindicación 6, en donde dicho disolvente orgánico polar aprótico se seleccionan de un grupo formado por dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), tetrahidrofurano (THF) y sus combinaciones. 14. 8. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que cataliza la hidrólisis enzimática de un éster carboxílico contenido en un compuesto, o la hidrólisis enzimática de una lactona, o la hidrólisis enzimática de una lactama, o la obtención de un halogenuro orgánico. 15. 9. Una proteína de fusión que comprende: i) un polipéptido A que comprende un polipéptido según cualquiera de las revindicaciones 1 a 8; y 16. ii) un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B es un polipéptido diferente a dicho polipéptido A. 17. 10. Proteína de fusión según la reivindicación 9, en donde dicho polipéptido B es un polipéptido útil para aislar y/o purificar proteínas. 18. 11. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en donde dicho polipéptido B se selecciona del grupo formado por una cola de histidinas, una cola de argininas, FLAG-tag, Strep-tag, xmyc-tag, SBP-tag, S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a quitina, glutatión S-transferasa-tag, proteína de unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, galactosidasa y VSV-glicoproteína. 19. 12. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11. 20. 13. Una construcción génica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 12. 21. 14. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 12 o una construcción génica según la reivindicación 13. 22. 15. Vector según la reivindicación 14 en el que dicho vector es un vector de expresión. 23. 16. Un organismo que comprende un polinucleótido según la reivindicación 12, una construcción génica según la reivindicación 13, o un vector según la reivindicación 14 ó 15. 24. 17. Organismo según la reivindicación 16, en el que dicho organismo es un organismo mesófilo. 25. 18. Organismo según la reivindicación 17, en el que dicho organismo es una bacteria mesófila. 26. 19. Un procedimiento para obtener un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende cultivar un organismo según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido o proteína de fusión y si se desea, recuperar dicho polipéptido o proteína de fusión. 27. 20. Un método para hidrolizar enzimáticamente un éster carboxílico presente en un compuesto que comprende poner en contacto dicho compuesto que contiene un éster carboxílico con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o con una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, bajo condiciones adecuadas para la hidrólisis de dicho éster carboxílico. 28. 21. Método según la reivindicación 20, en el que dicho compuesto que tiene un grupo éster carboxílico es un compuesto de fórmula (I) 29. 30. R1-COOR2 31. (I) 32. donde 33. R1 y R2, independientemente entre sí, representan un radical de un compuesto orgánico que contiene al menos 1 átomo de carbono. 34. 22. Método según la reivindicación 20, en el que dicho compuesto que tiene un grupo éster carboxílico es un acilglicerol de cadena corta. 35. 23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que la hidrólisis enzimática se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 20ºC y 95ºC, opcionalmente en presencia de un agente caotrópico, y/o de un disolvente orgánico polar aprótico. 36. 24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que la hidrólisis enzimática se lleva a cabo en presencia de peróxido de hidrógeno. 37. 25. Un método para hidrolizar enzimáticamente una lactona que comprende poner en contacto dicha lactona con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o con una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, bajo condiciones adecuadas para la hidrólisis de dicha lactona. 38. 26. Método según la reivindicación 25, en el que la hidrólisis enzimática se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 20ºC y 95ºC, opcionalmente en presencia de un agente caotrópico, y/o de un disolvente orgánico polar aprótico. 39. 27. Un método para hidrolizar enzimáticamente una lactama que comprende poner en contacto dicha lactama con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o con una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, bajo condiciones adecuadas para la hidrólisis de dicha lactama. 40. 28. Método según la reivindicación 27, en el que la hidrólisis enzimática se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 20ºC y 95ºC, opcionalmente en presencia de un agente caotrópico, y/o de un disolvente orgánico polar aprótico. 41. 29. Un método para obtener enzimáticamente un halogenuro orgánico que comprende poner en contacto un compuesto orgánico con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o con una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en presencia de un haluro y de 42. 43. peróxido de hidrógeno, o una fuente de peróxido, en un medio que comprende protones, bajo condiciones adecuadas para la producción de dicho halogenuro orgánico. 44. 30. Método según la reivindicación 29, en el que dicha reacción enzimática se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 20ºC y 95ºC, opcionalmente en presencia de un agente caotrópico, y/o de un disolvente orgánico polar aprótico. 45. 46. A 47. B 48. FIG. 1 49. 50. B 51. A 52. D 53. E 54. FIG. 2 55. 56. FIG. 3 57. 58. A 59. B 60. FIG. 4 61. 62. A 63. B 64. FIG. 5 65. 66. FIG. 6 67. 68. A 69. B 70. FIG. 7 71. 72. FIG. 7 (cont.) 73. 74. FIG. 8 75. 76. FIG. 9 77. 78. FIG. 10