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Vibrio cholerae strains to capture integron cassettes (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)CM Patents

Índice de la ficha

Updated at
24/07/2026
Numero publicacion
WO.2025104363.A2
Fecha publicacion
22/05/2025
Numero solicitud
WO2024ES70711
Fecha presentacion
15/11/2024

En detalle

Resumen

Vibrio cholerae strains to capture integron cassettes. The invention relates to a strain of V. cholerae in which a platform for detecting integron cassettes has been constructed. The platform includes a blind reporter system constructed by inserting an attl integration site into the toxin gene of a toxin/antitoxin system, which is inserted into the bacterial chromosome; the corresponding antitoxin gene and the intl integrase gene, both included on plasmids. The invention also relates to strains of V. cholerae in which the superintegron ({del}SI) has been deleted, to the method for obtaining them, and to strains of V. cholerae {del}SI in which the platform of uptake of integron cassettes. The invention includes methods and kits for detecting integron cassettes by using the constructed strains and platforms. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Reivindicaciones

REIVINDICACIONES 1. Método para delecionar el superintegrón (SI) del cromosoma 2 de Vibrio cholerae mediante la deleción secuencial de los sistemas toxina/antitoxina (TA) que incluye los siguientes pasos: 1 - preparar una construcción con: - una región de homología izquierda (RHI) que es homologa a un fragmento de ADN de . cholerae comprendido entre intl y el gen de la antitoxina del sistema TA que se quiere eliminar y tiene un tamaño aproximado de 500 bp; - una región de homología derecha (RHD) que es homologa a un fragmento de ADN de . cholerae que comprende el gen completo de la antitoxina del sistema TA que se quiere eliminar y, opcionalmente, la región promotora de la toxina correspondiente, y tiene un tamaño aproximado de 500 bp; - el gen de un marcador selectivo; y unir estos tres elementos en un único fragmento que tiene el gen del marcador selectivo situado entre la RHI y la RHD; 2 - introducir la construcción obtenida en la bacteria en la que se quieren eliminar los sistemas TA e inducir el intercambio alélico con el cromosoma de la bacteria; 3 - repetir los pasos 1-2 para todos los sistemas TA que se quieran eliminar con el gen de un marcador selectivo diferente al utilizado en la construcción anterior; 4 - realizar una deleción limpia de los restos de SI que queden en el cromosoma y del último marcador de resistencia, tras el paso 3. 2. Método para delecionar el SI del cromosoma 2 de . cholerae según la reivindicación 1 donde, en el paso 3, se selecciona la misma RHI que en el paso 1. 3. Método para delecionar el SI de . cholerae según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que se seleccionan 3 genes de 3 marcadores selectivos diferentes y se van alternando en las construcciones sucesivas. 4. Método para delecionar el SI de . cholerae según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que incluye la utilización de una RHI diferente a la definida en el paso 1 y el mantenimiento de dos marcadores selectivos en reemplazos alélicos consecutivos. 5. Cepa de . cholerae caracterizada porque se le ha delecionado el SI de su cromosoma 2 (cepa V. cholerae ASI) mediante el método definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-4. 6. Cepa de V. cholerae ASI depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con la referencia CECT30916. 7. Cepa de V. cholerae según cualquiera de las reivindicaciones 5-6 que incluye una plataforma para captar casetes de integrones que incluye: - un sitio de integración attl insertado en el gen que codifica una toxina de un sistema toxina/antitoxina, - el gen de la antitoxina de la toxina de dicho sistema toxina/antitoxina, - el gen de la integrasa intl, donde el sitio de integración attl está insertado en el gen de la toxina sin modificar la funcionalidad de la proteína y donde el gen que codifica la toxina y tiene el sitio de integración attl insertado está incluido en el cromosoma de la cepa de V. cholerae o bacteria hospedadora, el gen que codifica la antitoxina está incluido en un plásmido, y el gen intl está incluido en un plásmido. 8. Cepa de V. cholerae según la reivindicación 7 en la que el sitio de integración es attH. 9. Cepa de V. cholerae según cualquiera de las reivindicaciones 7-8 en la que el sistema toxina/antitoxina incluido en la plataforma para captar casetes de integrones es el sistema ccdB/ccdA. 10. Cepa de V. cholerae según la reivindicación 9 en la que el gen ccdB con el sitio de integración attl incluido en la plataforma para captar casetes de integrones se corresponde con la secuencia SEQ ID NO: 39. 11. Cepa de V. cholerae según cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en la que el gen de la toxina incluido en la plataforma para captar casetes de integrones incluye el gen NPU de una inteína a continuación del sitio de integración attl. 12. Cepa de V. cholerae según la reivindicación 11 en la que el gen ccdB con el sitio de integración attl y la inteína NPU insertados, incluido en la plataforma para captar casetes de integrones, se corresponde con la secuencia SEQ ID NO: 41. 13. Cepa de V. cholerae según cualquiera de las reivindicaciones 7-12 en la que la plataforma para captar casetes de integrones incluye el gen de la antitoxina en un plásmido. 14. Cepa de V. cholerae según cualquiera de las reivindicaciones 7-13 en la que la plataforma para captar casetes de integrones incluye el gen de la integrasa intl en un plásmido. 15. Cepa de V. cholerae según la reivindicación 14 en la que el plásmido donde está incluido el gen intl es de alto número de copias. 16. Cepa de V. cholerae según cualquiera de las reivindicaciones 7-15 en la que los promotores del gen de la toxina y del gen intl incluidos en la plataforma para captar casetes de integrones son promotores inducibles y el promotor del gen de la antitoxina incluido en la plataforma para captar casetes de integrones es un promotor constitutivo. 17. Cepa de V. cholerae según la reivindicación 16 en la que el promotor del gen de la toxina es PyetM, el promotor del gen intl es PBAD y el promotor del gen de la antitoxina es PcS. 18. Cepa de V. cholerae según cualquiera de las reivindicaciones 7-17 en la que el gen de la integrasa es intH. 19. Cepa de V. cholerae depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con la referencia CECT30917. 20. Método de detección de casetes de ¡ntegrón de una cepa bacteriana bajo estudio que incluye poner en contacto la cepa bajo estudio con la bacteria hospedadora de V. cholerae definida en cualquiera de las reivindicaciones 7-19 en condiciones que permitan la conjugación de plásmidos de la cepa bajo estudio, y la recombinación de los casetes de ¡ntegrón de la cepa bajo estudio en el sitio attl de la plataforma para captar casetes de integrones incluida en la bacteria hospedadora. 21. Kit para la detección de casetes de ¡ntegrón en muestras de ADN que incluye cualquiera de las bacterias definidas en las reivindicaciones 7-19. 22. Kit para la detección de casetes de ¡ntegrón en muestras de ADN según la reivindicación 21 en el que las bacterias son células competentes.

Etiquetas

Inventores
Escudero Garcia-Calderon Jose AntonioTrigo da Roza Moutinho FilipaBlanco Torres PaulaMazel DidierLopez Igual Mª del RocioEscudero García-Calderón José AntonioLópez Igual María del Rocío
Solicitantes
Universidad Complutense de MadridPasteur InstitutInstitut Pasteur
Clasificacion ipc
C12N 1/ 20 A IC12N 1/ 21 A IC12N 15/ 11 A IC12N 15/ 63 A I
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