Resumen
The invention relates to a novel fructofuranosidase activity for obtaining the prebiotic oligosaccharide 6-kestose. One object of the invention is to characterize a novel transfructosylase activity which is associated with the extracellular invertase of Schwanniomyces occidentalis (specifically the strains selected from the group consisting of ATCC260077, ATCC7410 and ATCC20499) and which can be used to obtain prebiotic oligosaccharides, mainly 6-kestose, which are widely used in the food industry. Another object of the invention relates to the method for obtaining an enzymatic product as well as to the substantially pure enzyme with fructofuranosidase activity.
Reivindicaciones
1. 1. Procedimiento de obtención de un productoenzimático con actividad fructofuranosidasa, que comprende cultivarcélulas de Schwanniomyces occidentalis (tambiénDebar y omyces occidentalis) en un medio para levaduras quecontiene lactosa, a una temperatura de 29ºC y agitación orbitalconstante de 235 rpm. 2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1 quecomprende cultivar células de Schwanniomyces occidentalis enun medio mínimo o rico para levaduras que contiene una de lassiguientes fuentes de carbono: lactosa, sacarosa, rafinosa oglucosa, a una temperatura comprendida entre 28 y 30ºC y un rangode agitación orbital constante comprendido entre 180 y 235 rpm. 3. 3. Procedimiento según la reivindicaciones 1 y2, que comprende la etapa adicional de recuperar el productoenzimático mediante centrifugación, del medio de cultivo y/o de lascélulas. 4. 4. Procedimiento según cualquiera de lasreivindicaciones 1 a 3, donde las células de Schwanniomycesoccidentalis pertenecen a una cepa seleccionada del grupo queconsiste en ATCC26077, ATCC26076, y ATCC20499. 5. 5. Producto enzimático con actividadfructofuranosidasa obtenible por el procedimiento definido encualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadoporque la actividad fructofuranosidasa tiene baja especificidad desustrato, actuando sobre sacarosa, 1-kestosa, nistosa y rafinosa. 6. 6. Producto enzimático según la reivindicación5, caracterizado porque no tiene actividadfructofuranosidasa sobre lactosa, leucrosa, turanosa opalatinosa. 7. 7. Producto enzimático según cualquiera de lasreivindicaciones 5 y 6, donde la actividad fructofuranosidasapresenta un máximo en el intervalo de pH entre 5 y 6 unidades a50ºC, y en un intervalo de temperatura de 40 a 55ºC. 8. 8. Producto enzimático según cualquiera de lasreivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque tiene actividadtransfructosidasa en presencia de uno o varios sustratosglucídicos. 9. 9. Producto enzimático según la reivindicación8, caracterizado porque los sustratos glucídicos sonfructooligosacáridos. 10. 10. Producto enzimático según la reivindicación9, donde los productos resultantes de la actividadtransfructosidasa son fructooligosacáridos con enlacesβ-1, 2, y β-2, 6. 11. 11. Producto enzimático según la reivindicación10, donde los productos resultantes de la actividadtransfructosidasa son básicamente 6-kestosa y1-kestosa. 12. 12. Procedimiento de obtención de oligosacáridosque comprende permitir que el producto enzimático definido encualquiera de las reivindicaciones 5 a 11 actúe sobre uno o variossustratos glucídicos. 13. 13. Procedimiento de obtención de una enzimapura con actividad fructofuranosidasa, a partir del productoenzimático obtenido por el procedimiento según las reivindicaciones1 y 2, que comprende la etapa adicional de purificar el productoenzimático hasta obtener la enzima pura, comprendiendo dicha etapade purificación los siguientes pasos: 14. a) concentración de la fracción extracelularmediante un sistema de filtración tangencial, seguida dediálisis, 15. b) comatograffa de intercambio iónico a pH 7seguida de diálisis, y 16. c) comatograffa de intercambio iónico a pH5. 17. 14. Procedimiento según la reivindicación 13, donde las células de Schwanniomyces occidentales pertenecena una cepa seleccionada del grupo que consiste en ATCC26077, ATCC26076, y ATCC20499. 18. 15. Enzima pura con actividad fructofuranosidasaobtenible por el procedimiento definido en cualquiera de lasreivindicaciones 13 y 14, caracterizada porque la actividadfructofuranosidasa tiene baja especificidad de sustrato, actuandosobre sacarosa, 1-kestosa, nistosa y rafinosa. 19. 16. Enzima según la reivindicación 15, caracterizada porque no tiene actividad fructofuranosidasasobre lactosa, leucrosa, turanosa, palatinosa, 20. 17. Enzima según cualquiera de lasreivindicaciones 15 y 16 donde la actividad fructofuranosidasapresenta un máximo en el intervalo de pH entre 5 y 6 a 50ºC, y enun intervalo de temperatura entre 40 y 55ºC. 21. 18. Enzima según cualquiera de lasreivindicaciones 15 a 17, caracterizada porque tieneactividad transfructosidasa en presencia de uno o varios sustratosglucídicos. 22. 19. Enzima según la reivindicación 18, caracterizada porque los sustratos glucídicos sonfructooligosacáridos. 23. 20. Enzima según la reivindicación 19, donde losproductos resultantes de la actividad transfructosidasa sonoligosacáridos con enlaces β-1, 2, yβ-2, 6. 24. 21. Enzima según la reivindicación 20, donde losproductos resultantes de la actividad transfructosidasa sonbásicamente 6-kestosa y1-kestosa. 25. 22. Enzima según cualquiera de lasreivindicaciones 15 a 21, caracterizada por su secuenciaaminoacídica SEC. ID. No. 1 y por presentar 535 aminoácidos. 26. 23. Secuencia de ADN que codifica la enzimadefinida en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, caracterizada por su secuencia nucleotídica SEC. ID. No.4. 27. 24. Procedimiento de obtención de oligosacáridosque comprende permitir que la enzima definida en cualquiera de lasreivindicaciones 15 a 23 actúe sobre uno o varios sustratosglucídicos.
